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生体深部を高速かつ広い視野で観察できる光シート顕微鏡愛媛大学大学院 大嶋 佑介

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 レーザー顕微鏡技術を基盤とするバイオイメージングが医学・生物学研究に幅広く応用されている昨今,レーザー光源の小型化・安定化,光検出デバイスの高速化・高感度化,さらに画像取得様式の工夫・改良といった光学分野の技術革新とともにバイオイメージング技術も進歩し続けている。著者らは,レーザービームをシート状に成形して観察対象を照明する光シート顕微鏡技術と高パルスエネルギーのフェムト秒レーザーによる2光子励起蛍光イメージング技術を融合することで,生体深部をこれまでにない広い視野(1mm以上)において鮮明に観察することに成功した(図1)。観察の対象とした生物試料は,蛍光タンパク質(DsRed2)を全身で発現するように遺伝子導入されたメダカの稚魚で,図2に示すようにアガロースゲル中に埋めて保持されている。励起光は,レーザービームをガルバノスキャナーでスキャンすることによって擬似的な光シートを形成し,観察したい面を選択的に照射する。そして,光シートに対して垂直な方向からCCDカメラで蛍光イメージを取得する。これが光シート顕微鏡の撮像原理であり,光学断層効果によって深部観察が可能である。これに2光子励起を導入すると,光毒性の軽減や空間分解能および深部到達性の向上が期待されるのだが,通常2光子励起顕微鏡に用いられている近赤外レーザーでは,2光子励起に必要な光子密度が不足するために,視野が狭くなってしまう。この欠点を克服するため,今回開発した2光子励起光シート顕微鏡では,加工用の高パルスエネルギー近赤外レーザーを搭載し,低いNA(開口数)で照射用対物レンズに入射して光シートを形成することで,広範囲にわたって効率的に2光子励起蛍光を観察することに成功した。さらに,広い視野を達成したことに加えて,光シート顕微鏡の利点である高速イメージングにも挑戦し,ビデオレートに近い画像取得速度(20フレーム/秒)で生きたメダカの心臓の動きを撮影することに成功した(図3)。本顕微鏡技術の開発によって,従来の2光子励起光シート顕微鏡の視野に入りきれなかった,より進んだステージの発生胚のライブイメージングが可能となり,発生学の研究の発展に貢献する期待される。また,メダカ,ゼブラフィッシュなど小型動物の全身イメージングが可能となり,魚類を用いた疾患モデルの解析や薬剤スクリーニングの評価など医学研究への応用展開も期待される。

参考文献

  • Atsushi Maruyama, Yusuke Oshima, Hiroko Kajiura-Kobayashi, Shigenori Nonaka, Takeshi Imamura, and Kiyoshi Naruse,“Wide field intravital imaging by two-photonexcitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM)with a high-pulse energy laser,” Biomedical Optics Express, 5(10), 3311-25(2014)DOI:10.1364/BOE.5.003311

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